突破性脑深层成像：无标记多光子光声显微技术（LF-MP-PAM）开启神经科学新纪元
长期以来，深入且高精度地观察活体大脑组织，尤其是在皮层下方诸如海马体等深层区域的代谢和神经元活动，一直是神经科学和临床研究领域面临的巨大挑战。传统显微技术往往受限于穿透深度、散射效应以及对外部荧光标记的需求，这不仅增加了实验的复杂性，也限制了其在人体应用中的潜力。然而，一项由麻省理工学院科学家和工程师团队共同开发的创新显微系统——无标记多光子光声显微技术（Label-Free Multiphoton Photoacoustic Microscopy, LF-MP-PAM）——正逐步克服这些障碍，有望为我们理解大脑功能障碍和疾病开辟前所未有的窗口。
该研究的核心突破在于其能够以单细胞分辨率深入脑组织内部，探测细胞的分子活动。正如项目主要作者之一、神经科学家Mriganka Sur教授所强调，这一重大进展使科学家能够更深入地观察，同时保持对个体细胞的精细解析度。这项技术巧妙地融合了多种前沿成像原理，实现了在无需任何外部标记（无论是化学染料还是基因工程荧光蛋白）的情况下，对深层脑组织进行高清晰度成像。
LF-MP-PAM的技术原理与优势
LF-MP-PAM系统结合了三光子激发（Three-Photon Excitation）和光声探测（Photoacoustic Detection）两大核心技术，共同实现了对生物分子的高效、深度探测。其创新性主要体现在以下几个方面：
三光子激发实现深层穿透：
- 长波长优势：与传统近紫外光激发不同，LF-MP-PAM使用波长更长、强度极高的超短激光脉冲（仅持续千万亿分之一秒），以三倍于正常吸收波长的能量激发目标分子。长波长光在生物组织中具有更强的穿透力，散射效应显著减弱，如同“雾灯”般能够穿透浓密的脑组织。这使得研究人员能够以前所未有的深度激发目标分子，而不必担心光信号在传播过程中迅速衰减。
- 高效能量传递：尽管每次激发产生的荧光信号相对微弱，但大部分被吸收的能量会在细胞内产生局部（约10微米）热膨胀。这种热膨胀进一步产生声波，而声波在生物组织中的传播损耗远小于光信号，从而为深层探测提供了理想的载体。
光声探测提升分辨率与灵敏度：
- 声波传递信息：系统配备了高灵敏度的超声麦克风，能够精确捕获由细胞热膨胀产生的声波。这些声波携带着细胞内部分子活动的丰富信息，为图像重建提供了基础。
- 高分辨率图像重建：通过收集足够的声波数据，结合先进的软件算法，系统能够将这些声学信号转化为高分辨率的图像，其原理与超声波检查（sonogram）相似。这种“多光子输入，声波输出”（Multiphoton-In and Acoustic-Out）的平台，是该技术实现深度和清晰度的关键。
无标记优势：
- 天然生物分子探测：LF-MP-PAM系统最显著的优势之一是其“无标记”特性。它能够直接探测细胞内固有的生物分子，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[NAD(P)H]。NAD(P)H是一种与细胞代谢和神经元电活动密切相关的关键分子，其水平变化能直接反映细胞的生理状态。由于无需引入外源性标记物，该技术极大地降低了对生物样本的干扰，并为未来在人体内的直接应用提供了可能性。
- 更广泛的应用前景：去除标记的需求意味着研究人员可以更自然地观察生物过程，避免了标记物可能带来的毒性、荧光漂白或对细胞功能的潜在影响。这使得研究结果更具生理相关性，也拓展了其在临床诊断中的应用潜力。
卓越的成像能力与潜在检测目标
该研究团队在《Light: Science and Applications》杂志上发表的成果中，展示了LF-MP-PAM系统卓越的成像深度和分辨率。他们成功地在1.1毫米厚的“脑类器官”（由人类干细胞生成的三维迷你大脑组织）以及0.7毫米厚的小鼠脑组织切片中，清晰地探测到了NAD(P)H分子的信号。值得注意的是，联合主要作者、机械工程博士后W. David Lee表示，测试样本的尺寸限制了系统展现更深层成像的能力，他们相信该系统能够穿透更深的组织。
与现有其他显微技术相比，LF-MP-PAM在探测致密脑组织中的NAD(P)H方面，穿透深度增加了五倍以上，且保持了单细胞级别的分辨率。研究还表明，该系统能够同时进行“三谐波生成”（Third-Harmonic Generation）成像，该技术能精确呈现细胞结构，与光声成像协同工作，提供更全面的组织信息。此外，研究人员还指出，这种光声方法有望检测其他生物分子，例如神经科学家用于指示神经元电活动的基因编码钙指示剂GCaMP，进一步扩展了其应用范围。
广阔的应用前景与临床转化潜力
LF-MP-PAM技术的建立，为神经科学和临床医学带来了激动人心的应用前景。其无标记的特性使其尤其适用于对人类进行研究和诊断，例如在脑部手术中实时监测脑组织状态。
神经科学研究：
- 深度脑区探索：该系统能够深入探索传统方法难以触及的脑区，如海马体等对学习和记忆至关重要的结构，有助于揭示这些区域在正常生理和病理状态下的功能机制。
- 疾病机制研究：NAD(P)H水平的变化与阿尔茨海默病、雷特综合征和癫痫等多种神经系统疾病密切相关，使其成为潜在的生物标志物。通过LF-MP-PAM监测NAD(P)H的动态变化，科学家可以更深入地理解这些疾病的发生发展机制，并评估潜在治疗策略的效果。
临床医疗应用：
- 精准伤口护理：W. David Lee曾通过其创立并出售的公司Precision Healing, Inc.，证实NAD(P)H成像可以指导伤口护理。这一经验为LF-MP-PAM在其他临床领域的应用提供了参考。
- 术中监测与诊断：由于无需外部标记，LF-MP-PAM在人体内的应用成为可能。例如，在脑部手术中，外科医生可以利用该技术实时、高分辨率地观察深层脑组织，评估组织健康状况、识别病变边界，从而提高手术的精准性和安全性。
挑战与展望：迈向活体成像的未来
尽管LF-MP-PAM在体外和离体组织中展现出巨大潜力，但将其应用于活体动物，并最终应用于人体，仍然面临技术挑战。目前的研究中，超声麦克风通常放置在样本的另一侧以最大化信号接收。然而，在活体动物实验中，麦克风需要与光源一同放置在样本顶部。研究团队正积极攻克这一技术难题，并对实现活体大脑中2毫米深度的全成像充满信心。
Lee教授表示，基于现有研究结果，在活体大脑中实现2毫米深度的成像完全可行。一旦这些技术障碍被克服，LF-MP-PAM将有望成为神经科学和临床诊断领域的革命性工具。它不仅能帮助我们以前所未有的细节水平，理解大脑的复杂工作原理，还能为神经系统疾病的早期诊断、精准治疗以及新疗法开发提供强大的技术支持，真正开启一个通过声音“看见”大脑深层奥秘的新篇章。
图示：一个复杂的显微镜系统，整合了光学、电子及其他设备，是此项突破性研究的核心。
图示：来自研究图示的修改版本，左侧蓝色清晰显示脑类器官细胞内的NAD(P)H分子通过光声技术检测，右侧则为光学检测的模糊灰度图像，图像深度为0.2毫米。
