深度脑成像的百年挑战与革命性突破
长期以来，深度、高分辨率的脑组织成像一直是神经科学和临床医学领域的巨大挑战。传统显微技术往往受限于光散射和组织穿透深度，难以在不损害组织的前提下，清晰捕捉皮层下方深层脑区（如海马体）的细胞活动。然而，麻省理工学院科学家和工程师团队近期在《光：科学与应用》期刊上发布的一项研究，提出了一种结合多项前沿技术的全新显微镜系统，有望彻底改变这一局面，实现活体脑组织中分子活动的超深度、单细胞分辨率无标记成像。
这项技术的核心突破在于能够深入脑组织内部，以单细胞级别探测到与细胞代谢和神经元电活动紧密相关的关键分子NAD(P)H。团队在实验中成功穿透了1.1毫米厚的人类干细胞生成“脑类器官”和0.7毫米厚的小鼠脑组织切片，这比现有多数显微技术能够解析NAD(P)H的深度提升了五倍以上，标志着在组织穿透深度上的一个里程碑式进展。研究人员甚至认为，目前的测试样品尺寸限制了其潜力的完全展现，该系统具备探测更深层次组织的能力。
新一代显微技术的核心原理：三光子与光声的融合
该新型显微镜系统之所以能实现前所未有的深度和清晰度，得益于其巧妙融合了多种先进技术，以高效、精确地激发目标分子并捕获其释放的能量，且整个过程无需任何外部标记物，无论是化学添加剂还是基因工程荧光蛋白。这种“多光子输入，声学输出”（Multiphoton-In and Acoustic-Out）的平台，集成了三光子激发、无标记检测和光声探测三大核心优势。
三光子激发的深层优势
传统上，NAD(P)H的激发通常依赖于近紫外光，但这类短波长光在生物组织中极易散射，导致穿透深度受限。该团队的创新之处在于，使用一种强度极高、持续时间仅为飞秒（千万亿分之一秒）的超短激光脉冲，在NAD(P)H正常吸收波长的三倍处进行激发，即“三光子激发”。这种长波长的激发光（类似于汽车的雾灯）能显著减少在脑组织中的散射，从而穿透更深。这是一种非线性光学效应，通过同时吸收三个低能量光子来达到单高能量光子的激发效果，但其发生概率需要极高的光子密度，因此需要飞秒激光器提供瞬间的超高功率。
光声信号的精准捕捉
当NAD(P)H分子被三光子激发后，虽然会产生微弱的荧光信号，但更重要的是，大部分吸收的能量会转化为局部的热膨胀（约10微米范围内），进而产生声波。与光信号相比，声波在生物组织中的传播衰减更小、散射更弱，因此能更有效地穿透深层组织。显微镜中集成的高灵敏度超声换能器能够精确探测到这些由热膨胀产生的声波。通过收集足够多的声学数据，结合先进的软件算法，可以重建出高分辨率的图像，其原理与超声诊断（B超）类似，但分辨率达到了细胞级别。研究团队将这种成像方式称为“三光子光声成像”。
通过将这些前沿技术有机整合，研究人员Osaki和Lee与团队成员Zhang和Zubajlo成功展示了该系统在不同样品中可靠检测声学信号的能力。他们还同步进行了“三谐波产生”（third-harmonic generation）成像，该技术同样源于三光子激发，能够清晰呈现细胞结构，与光声成像形成的NAD(P)H图像互为补充，为研究人员提供了更全面的细胞生理状态信息。此外，该光声方法还具备检测其他生物分子的潜力，例如神经科学家常用于指示神经电活动的基因编码钙指示剂GCaMP，这无疑拓宽了其应用范畴。
关键成果与里程碑数据
此次研究的显著成果在于实现了对NAD(P)H分子的无标记、深层成像。在活体脑组织模拟物——脑类器官中，成功实现了1.1毫米的穿透深度；在离体小鼠脑组织切片中，也达到了0.7毫米的成像深度。这些数据远超现有其他NAD(P)H成像技术的性能极限。重要的是，这种深度并非理论极限，研究团队相信在更大的样品中可以展现出更深的穿透能力。例如，许多双光子显微镜在脑组织中的有效穿透深度通常在数百微米，而此次的毫米级深度，无疑是显微成像领域的一个重大跨越。
同时，该系统在保证深度的前提下，依然维持了单细胞级别的分辨率，这意味着科研人员可以观察到单个细胞甚至细胞器层面的代谢和功能变化，这对于理解复杂神经回路的功能和疾病发生机制至关重要。与传统的荧光标记方法相比，无标记的特性不仅简化了实验流程，更避免了外源物质可能带来的生物毒性或对生理状态的干扰，从而获得更接近生理真实的数据。
无标记成像的独特价值与广阔应用
该“无标记多光子光声显微镜”（LF-MP-PAM）概念的提出，为神经科学和临床医学打开了全新的研究与应用大门。其核心价值在于能够在不引入任何外源标记物的情况下，直接探测内源性生物分子，这对于生物活体成像和转化医学具有深远意义。
神经科学研究的新视角
对于神经科学家而言，该技术提供了前所未有的工具来探索大脑深层区域的运作机制。NAD(P)H作为细胞代谢的关键参与者，其水平变化与神经元的能量状态、电活动以及多种神经系统疾病（如阿尔茨海默病、瑞特综合征和癫痫发作）密切相关。通过高分辨率、深层次的NAD(P)H成像，研究人员可以更深入地理解这些疾病的病理生理过程，追踪疾病进展中的代谢异常，并评估潜在治疗策略的效果。例如，在阿尔茨海默病的研究中，NAD(P)H的异常代谢常被视为疾病早期阶段的生物标记物，这种新型显微镜或能提供更早、更精确的诊断依据。
临床诊断与治疗的潜在变革
由于其无标记的特性，该系统具备直接应用于人体的巨大潜力。例如，在脑外科手术中，外科医生可以利用它实时监测手术区域周围脑组织的代谢状态，精确区分健康组织与病变区域，从而指导手术操作，最大程度地保护患者的神经功能。Lee博士此前在伤口护理领域就已证实NAD(P)H成像的临床价值，这进一步印证了其在活体组织监测方面的应用潜力。未来，它有望成为神经疾病早期诊断、预后评估以及药物筛选的重要辅助工具，尤其是在那些需要避免侵入性标记手段的临床场景。
未来展望：活体成像的挑战与前景
尽管目前的研究主要在体外和离体组织上取得了成功，但团队的下一步目标是在活体动物模型中验证这项技术。这将带来新的技术挑战，例如，为了在活体动物中实现成像，超声换能器不能再像在体外实验中那样放置在样品下方，而需要与光源同侧放置，即均位于顶部。这需要对系统设计进行进一步的优化和调整，以确保信号采集的有效性。
然而，研究团队对在活体大脑中实现2毫米甚至更深度的全成像充满信心。Lee博士表示：“原则上，这项技术应该可行。”若能成功应用于活体动物，并最终拓展至人体临床应用，无疑将为神经科学研究提供一个前所未有的窗口，使我们能够更深入地理解大脑的复杂功能和疾病机制，为开发更有效的大脑疾病诊断和治疗方法奠定坚实基础。这项技术的未来发展值得我们持续关注，它可能不仅仅是显微技术的一次迭代，更可能代表着人类认识自身大脑旅程中的一个新起点。
